（注意：以下举例为常规qPCR 反应体系和反应程序，实际操作中应根据模板、引物结构和目的 片段大小不同进行相应的改进和优化） 1. 根据以下表格配置反应体系，总体积为20 μl试剂用量终浓度2 × Probe qPCR Mix10 μl1 ×正义引物 (10 μM)0.5 μl0.25 μM反义引物 (10 μM)0.5 μl0.25 μM探针(10 μM)0.5 μl0.25 μM模板 DNAx μlDEPC-ddH2OUp to 20 μl注意：1）通常引物浓度以 0.25 μM 可以得到较好结果，可以在 0.1 ~ 1.0 μM 作为设定范围的参考。 2）使用的探针浓度，与使用的荧光定量 PCR 仪、探针种类、荧光标记物质种类有关，实际使用时 请参照仪器说明书，或各荧光探针的具体使用要求进行浓度的调节。 3）通常 DNA 模板的量以 10-100 ng 基因组 DNA 或 1-10 ng cDNA 为参照，因不同物种的模板中含 有的目的基因拷贝数不同，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。 2. qPCR 反应程序，两步法 PCR：过程温度时间预变性95℃5 min35 ~ 40cycles变性95℃15 sec退火/延伸60℃30 sec（注意：建议采用两步法 PCR 反应程序，若因使用 Tm 值较低的引物等原因，得不到良好的实验结 果时，可尝试进行三步法 PCR 扩增，退火温度请以 55℃ - 65℃的范围作为设定参考）
（注意：以下举例为常规qPCR 反应体系和反应程序，实际操作中应根据模板、引物结构和目的 片段大小不同进行相应的改进和优化） 1. 将DNA模板、引物、2×SYBR qPCR Mix、50 × ROX Reference Dye I/II溶解并置于 冰上备用。 2. 根据以下表格配置反应体系，总体积为20 μl。试剂用量终浓度2 ×SYBR qPCR Mix10 μl1 ×正义引物 (10 μM)0.5 μl0.25 μM反义引物 (10 μM)0.5 μl0.25 μM模板DNAx μl50× ROX Reference Dye I or II0.4 μl1 ×ddH2OUp to 20 μl（注意：a.通常引物浓度以 0.25 μM 可以得到较好结果，可以终浓度 0.1-1.0 μM 作为设定范围的参 考。扩增效率不高的情况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化 反应体系；b.通常 DNA 模板的量以 10-100 ng 基因组 DNA 或 1-10 ng cDNA 为参照，因不同物种的 模板中含有的目的基因拷贝数不同，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。)需使用 ROX Reference Dye I 的机型：ABI Prism5700、7000、7300、7700、7900、7900HT、 7900HT Fast、Step-One、Step-One Plus。 需使用 ROX Reference Dye II 的机型： ABI Prism 7500/7500Fast 、 ViiA7, QuantStudio3/5/6Flex/7Flex, Stratagene MX4000/MX3005P/MX300...
1. 易错PCR体系推荐反应体系（30 μl）试剂用量模板DNA10-100 ngPrimer F (10 μM)1 μlPrimer R (10 μM)1 μl2× Error Prone PCR Mix15 μl10× MnCl23 μlddH2OUp to 30 μl2. 易错PCR程序 按用户已经优化的PCR条件进行一定循环数的PCR，如果没有优化的PCR条件，可 先尝试下面的PCR程序。过程温度时间预变性94℃3 min30-60 cycles变性94℃30 sec退火45℃30 sec延伸72℃1 min/kb3. 结果检测：反应结束后取5 μl反应产物，加入适量上样缓冲液，然后进行琼脂糖凝 胶电泳，检测是否得到预期片段大小的PCR产物。4. 胶回收易错PCR扩增产物、克隆并对单菌落进行功能筛选或测序分析、如果需要增 加突变率，可以突变后的DNA为模板，进行连续易错PCR。
1. 没有RNA产物。 最常见原因是模板有RNase污染，可用纯化好的RNA跟模板DNA一起保温再电泳， 再检测其是否有污染。 2. RNA产量低。 最常见的原因是DNA模板。在转录序列的第一个和第二个碱基最好都是G，在前14 个碱基内避免有U存在。 3. RNA长度比预期的短。 可能是模板序列中有T7 RNA聚合酶的终止序列。 4. RNA长度比预计的长。 T7 RNA聚合酶跟Taq DNA聚合酶一样，有不依赖于模板的加尾功能，最多有一半 的RNA可以带一个或两个碱基的尾巴。如果RNA长度比预计的长很多，使用的模板 又是 质粒DNA，则可能是质粒线性化不彻底。5. 5′单磷酸还是三磷酸? 如果使用GTP，则得到的RNA是三磷酸，体外转录时如果保温时间太长（如12小 时），则有50%的三磷酸会变成单磷酸。如果在转录体系中加入GMP，则T7 RNA聚 合 酶将优先使用GMP，所得RNA产物中5'端是单磷酸的比例将大大增加。 6. 用体外转录试剂盒如何得到带帽RNA? 需加入带帽NTP类似物即可。
（注意：以下举例为推荐PCR体系和反应条件，实际操作中应根据模板、引物结构和目的片段大小不同进行相应的调整和优化）1. PCR体系推荐反应体系（20 μl）试剂用量模板DNAPrimer mix (10 μM each)0.5 μl10 × Multiplex Buffer2 μlMultiplex DNA Polymerase1 μldNTP（10mM）0.5 μlddH2OUp to 20 μl（注意：推荐引物反应终浓度为每条引物0.1 μM，可在0.05 - 0.4 μM之间调整。）2. PCR程序过程温度时间预变性95℃5 min25 ~ 35 cycles变性95℃30 sec退火55 ~ 65℃30 sec延伸72℃60 sec/kb最后延伸72℃5 min（注意：a. 多数情况下，使用默认退火温度即可。如扩增效果不佳，可通过设置退火温度梯度实验来摸索最适退火温度。b. 预变性时间为5 min，用于充分释放酶活。请勿降低温度或缩短时间。c. 对于低拷贝模板、长片段或者扩增片段较多的情况，可延长退火时间至3 min以提高扩增效率。d. 延伸时间以最长片段为准设定。适度延长延伸时间有助于提高扩增产量且有利于困难模板扩增。延伸时间过长可能会导致非特异性扩增增多。e. 扩增微量样本时，可通过增加循环数提高扩增产物量。循环数过多可能会导致非特异性扩增增多。）
（注意：以下举例为常规qPCR 反应体系和反应程序，实际操作中应根据模板、引物结构和目的 片段大小不同进行相应的改进和优化）1. 根据以下表格配置反应体系，总体积为20 μl试剂用量终浓度2 × Probe qPCR Master Mix10 μl1 ×正义引物 (10 μM)0.5 μl0.25 μM反义引物 (10 μM)0.5 μl0.25 μM探针(10 μM)0.5 μl0.25 μM50× ROX Reference Dye I or II0.4 μl1 ×模板DNAx μlDEPC-ddH2OUp to 20 μl注意：1）通常引物浓度以 0.25 μM 可以得到较好结果，可以在 0.1 ~ 1.0 μM 作为设定范围的参考。 2）使用的探针浓度，与使用的荧光定量 PCR 仪、探针种类、荧光标记物质种类有关，实际使用时 请参照仪器说明书，或各荧光探针的具体使用要求进行浓度的调节。 3）通常 DNA 模板的量以 10-100 ng 基因组 DNA 或 1-10 ng cDNA 为参照，因不同物种的模板中含 有的目的基因拷贝数不同，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。需使用 ROX Reference Dye I 的机型：ABI Prism5700、7000、7300、7700、7900、7900HT、 7900HT Fast、Step-One、Step-One Plus。 需使用 ROX Reference Dye II 的机型：ABI Prism 7500/7500Fast、ViiA7, Stratagene MX4000/MX3005P/MX3000P。 不需要使用 ROX 的机型：Bio-Rad CFX96, CFX384, ...