不含染料的 MasterMix 产品在 PCR 结束后需混合适量的上样缓冲液再上样电泳， 含染料的 MasterMix 产品在 PCR 结束后可以直接上样电泳。
不含染料的 MasterMix 产品在 PCR 结束后需混合适量的上样缓冲液再上样电泳， 含染料的 MasterMix 产品在 PCR 结束后可以直接上样电泳。
（注意：以下举例为常规PCR体系和反应条件，实际操作中应根据模板、引物结构和目的片段大小 不同进行相应的调整和优化） 1. PCR体系 推荐反应体系（20 μl）试剂用量模板 DNAPrimer 1 (10 μM)0.5 μlPrimer 2 (10 μM)0.5 μl2×Pfu PCR MasterMix10 μlddH2OUp to 20 μl（注意：引物浓度请以终浓度 0.1 - 1.0 μM 作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下，可提高引 物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系） 2. PCR 程序过程温度时间预变性94℃2 min变性94℃30 sec25 ~ 35cycles 退火55 ~ 65℃30 sec延伸72℃60 sec/kb最后延伸72℃5 min（注意：a 一般实验中退火温度比扩增引物的熔解温度 Tm 低 5℃，无法得到理想的扩增效率 时，适当降低退火温度；发生非特异性反应时，提高退火温度，由此优化反应条件。b 延伸时间应 根据所扩增片段大小设定，Pfu DNA Polymerase 的扩增效率为1 kb/min。c 可根据扩增产物的下游 应用设定循环数。如果循环次数太少，扩增量不足；如果循环次数太多，错配机率会增加，非特异 性背景严重。所以，在保证产物得率的前提下，应尽量减少循环次数） 3. 结果检测：反应结束后取5 μl反应产物，加入适量上样缓冲液（含染料的不用加）， 然后进行琼脂糖凝胶电泳检测。
（注意：以下举例为常规PCR体系和反应条件，实际操作中应根据模板、引物结构和目的片段大小 不同进行相应的调整和优化） 1. PCR体系 推荐反应体系（20 μl）试剂用量模板 DNAPrimer 1 (10 μM)0.5 μlPrimer 2 (10 μM)0.5 μl2×Pfu PCR MasterMix10 μlddH2OUp to 20 μl（注意：引物浓度请以终浓度 0.1 - 1.0 μM 作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下，可提高引 物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系） 2. PCR 程序过程温度时间预变性94℃2 min变性94℃30 sec25 ~ 35cycles 退火55 ~ 65℃30 sec延伸72℃60 sec/kb最后延伸72℃5 min（注意：a 一般实验中退火温度比扩增引物的熔解温度 Tm 低 5℃，无法得到理想的扩增效率 时，适当降低退火温度；发生非特异性反应时，提高退火温度，由此优化反应条件。b 延伸时间应 根据所扩增片段大小设定，Pfu DNA Polymerase 的扩增效率为1 kb/min。c 可根据扩增产物的下游 应用设定循环数。如果循环次数太少，扩增量不足；如果循环次数太多，错配机率会增加，非特异 性背景严重。所以，在保证产物得率的前提下，应尽量减少循环次数） 3. 结果检测：反应结束后取5 μl反应产物，加入适量上样缓冲液（含染料的不用加）， 然后进行琼脂糖凝胶电泳检测。
1. 去除基因组：根据以下表格配制反应体系，总体积为 10μl。为了保证反应液配制的准 确性，先按反应数+2 的量配制预混体系，然后再分装到每个反应管中，最后加入 RNA。10×gDNA Remover1 μlRNA 模板0.01~1μgDEPC-ddH2O补足至 10μl(注意：如果总 RNA 量大于 1 ug，请按比例扩大反应体系)将反应液轻轻搅拌均匀，短暂离心使管壁上的溶液收集到管底，室温或 25-37℃温育 5 分钟。 2. 反转录反应：在上述反应液中加入 4μl 5×cDNA RT Mix，6μl DEPC-ddH2O,轻轻混匀， 短暂离心；50℃孵育 5-15 分钟；85℃加热 3 分钟使酶失活；置于冰上进行后续实验或 冷冻保存。 注意：Real-time qPCR 时，作为模板直接稀释后添加（添加到 PCR 反应液中的反转录稀释液，尽 量不要超过 20%，以免导致 PCR 反应效率低下，无法准确定量）
1. PCR 体系：推荐体系（50 μl）试剂用量模板 DNA10 × Taq PCR Buffer5 μldNTP Mixture(2.5 mM each)4 μlPrimer 1 (10 μM)2 μlPrimer 2 (10 μM)2 μlTaq DNA Polymerase (2.5 U/μl)0.5 ~ 1 μlddH2OUp to 50 μl（注意：a 引物浓度请以终浓度 0.1-1.0μM 作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下，可提 高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。b 镁离子浓度请以 终浓度 1.5-3mM 作为设定范围的参考。可根据不同的引物对和模板来调节镁离子浓度，由此优化反应体系）2. PCR 程序过程温度时间预变性94℃5 min变性94℃30 sec25~35cycles 退火55-65℃30 sec延伸72℃1kb/30 sec终延伸72℃5 min（注意：a 一般实验中退火温度比扩增引物的熔解温度 Tm 低 5℃，无法得到理想的扩增效率时， 适当降低退火温度；发生非特异性反应时，提高退火温度，由此优化反应条件。b 延伸时间应根 据所扩增片段大小设定，Taq DNA Polymerase 的扩增效率为 1 kb/30 sec。c 可根据扩增产物的下 游应用设定循环数。如果循环次数太少，扩增量不足；如果循环次数太多，错配机率会增加，非 特异性背景严重。所以，在保证产物得率的前提下，应尽量减少循环次数）3. 结果检测：反应结束后取 5 μl 反应产物，加入适量上样缓冲液后进行琼脂糖凝胶电泳 检测。