（注意：以下举例为常规PCR 反应体系和反应条件，实际操作中应根据模板、引物结构和目的 片段大小不同进行相应的调整和优化） 1. PCR 体系： 推荐体系（50 ul）试剂用量模板 DNA10×快速高保真 Buffer5 μldNTP Mixture(2.5 mM each)4 μlPrimer 1 (10 μM)2 μlPrimer 2 (10 μM)2 μl快速高保真 DNA 聚合酶（突变型）0.5 ~ 1 μlddH2OUp to 50 μl2. PCR 程序过程温度时间预变性94℃5 min变性94℃30 sec25~35cycles 退火55-65℃30 sec延伸72℃1kb/15 sec终延伸72℃5 min（注意：a 一般实验中退火温度与扩增引物的熔解温度 Tm 相当，无法得到理想的扩增效率时， 适当降低退火温度；发生非特异性反应时，提高退火温度，由此优化反应条件。）3. 结果检测：反应结束后取 5 μl 反应产物，加入适量上样缓冲液后进行琼脂糖凝胶电泳 检测。
（注意：总反应体积为20 μl，总RNA的量为10 ng - 5 μg，若起始RNA的量小于50 ng，则建议加 入RNA酶抑制剂RNasin） 1. 将 5 × RT Buffer 和 M-MLV 反转录酶溶解并置于冰上备用，准备好 RNA 模板、引物 （oligo dT，随机引物，或者二者的 Primer Mix、或者特异性引物），dNTP Mix、DEPCddH2O 等。 2. 在无 RNase 的 PCR 管中加入引物，总 RNA (10 ng ~ 5 μg)或 mRNA(1 ~ 500 ng)，4 μl dNTP (2.5 mM each)，4 μl 5 × RT Buffer，1 μl M-MLV 反转录酶，补足 DEPC-ddH2O 至 20 μl。 3. 振荡混匀，离心数秒使反应液聚集于 PCR 管底部。 4. 42℃保温 15-60 min。85℃孵育 5min，反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。5. 该产物可直接用于第二链的合成或 RT- PCR 扩增反应，保存请置于-20℃。
1. 含有去除基因组 DNA 酶，反转录产物中不含有基因组 DNA，下游定量实验更 精确； 2. 逆转录效率高，第一链 cDNA 产量高； 3. 最长可合成 5 kb 的 cDNA 片段； 4. 5×All-in-one cDNA 1st Strand Mix 包含除 RNA 模板以外的所有试剂，方便实验 人员使用； 5. 逆转录反应的模板总 RNA 范围可以在 10 ng ~ 5 ug 之间； 6. 适合于从各种组织中提取的总 RNA 或 mRNA 为模板合成 cDNA 第一链、实时 荧光定量 RT-qPCR、3’-和 5’-RACE 等。
1. 在操作过程中应避免 RNase 污染，防止 RNA 降解或实验中的交叉污染，建议在专门的 区域进行 RNA 操作，使用专门的仪器和耗材，操作人员带口罩和一次性手套 并经常更 换手套。 2. 实验尽量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，应使用 0.1％DEPC（焦碳酸二乙 酯）水溶液在 37℃处理 12 小时，并在 120℃下高压灭菌 30 分钟后使用，或者将 玻璃 器皿在 180℃下干热灭菌 60 分钟后使用。实验中用到的无菌水应使用 0.1%的 DEPC 处 理后进行高压灭菌。 3. 本试剂盒中的所有试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后 使用。所涉及的酶类使用后应尽快放回-20℃，避免反复冻融。
1. 在操作过程中应避免 RNase 污染，防止 RNA 降解或实验中的交叉污染，建议在专门的 区域进行 RNA 操作，使用专门的仪器和耗材，操作人员带口罩和一次性手套并经常更 换手套。 2. 实验尽量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，应使用 0.1％DEPC（焦碳酸二乙 酯）水溶液在 37℃处理 12 小时，并在 120℃下高压灭菌 30 分钟后使用，或者将玻璃 器皿在 180℃下干热灭菌 60 分钟后使用。实验中用到的无菌水应使用 0.1%的 DEPC 处 理后进行高压灭菌。 3. 本试剂盒中的所有试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。所涉及的酶类使用后应尽快放回-20℃，避免反复冻融。 4. 本试剂盒必须使用特异性引物，引物的选择可根据具体实验来选择，引物设计的好坏 直接影响到 RT-PCR 反应的结果，设计引物时需考虑 GC 含量，引物长度，引物位 置，PCR 产物的二级结构等因素，建议采用专业的引物设计软件来设计。
（注意：以下举例为常规PCR反应体系和反应条件，实际操作中应根据模板、引物结构和目的 片段大小不同进行相应的调整和优化） 1. PCR 体系： 推荐体系（50 μl）试剂用量模板 DNA10 × Pfu Buffer5 μldNTP Mixture(2.5 mM each)4 μlPrimer 1 (10 μM)2 μlPrimer 2 (10 μM)2 μlPfu DNA Polymerase (2.5 U/μl)0.5 ~ 1 μlddH2OUp to 50 μl（注意：a 引物浓度请以终浓度 0.1-1.0μM 作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下，可提 高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。b 镁离子浓度请以 终浓度 1.5-3mM 作为设定范围的参考。可根据不同的引物对和模板来调节镁离子浓度，由此优 化反应体系）2. PCR 程序过程温度时间预变性94℃5 min变性94℃30 sec25~35cycles 退火55-65℃30 sec延伸72℃1kb/60 sec终延伸72℃5 min（注意：a.一般实验中退火温度比扩增引物的熔解温度 Tm 低 5℃，无法得到理想的扩增效率时， 适当降低退火温度；发生非特异性反应时，提高退火温度，由此优化反应条件。b.延伸时间应根 据所扩增片段大小设定，Taq DNA Polymerase 的扩增效率为 1 kb/60 sec。c.可根据扩增产物的下 游应用设定循环数。如果循环次数太少，扩增量不足；如果循环次数太多，错配机率会增加，非 特异性背景严重。所以，在保证产物得率的前提下，应尽量减少循环次数） 3. 结果检测：反应结束后取 5 μl 反应产物，加入适量上样缓冲液后进行琼脂糖凝胶电泳 检测。