（注意：以下举例为常规PCR体系和反应条件，实际操作中应根据模板、引物结构和目的片段大小 不同进行相应的调整和优化） 1. PCR体系 推荐反应体系（20 μl）试剂用量模板 DNAPrimer 1 (10 μM)0.5 μlPrimer 2 (10 μM)0.5 μl2×Pfu PCR MasterMix10 μlddH2OUp to 20 μl（注意：引物浓度请以终浓度 0.1 - 1.0 μM 作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下，可提高引 物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系） 2. PCR 程序过程温度时间预变性94℃2 min变性94℃30 sec25 ~ 35cycles 退火55 ~ 65℃30 sec延伸72℃60 sec/kb最后延伸72℃5 min（注意：a 一般实验中退火温度比扩增引物的熔解温度 Tm 低 5℃，无法得到理想的扩增效率 时，适当降低退火温度；发生非特异性反应时，提高退火温度，由此优化反应条件。b 延伸时间应 根据所扩增片段大小设定，Pfu DNA Polymerase 的扩增效率为1 kb/min。c 可根据扩增产物的下游 应用设定循环数。如果循环次数太少，扩增量不足；如果循环次数太多，错配机率会增加，非特异 性背景严重。所以，在保证产物得率的前提下，应尽量减少循环次数） 3. 结果检测：反应结束后取5 μl反应产物，加入适量上样缓冲液（含染料的不用加）， 然后进行琼脂糖凝胶电泳检测。
1. 缓冲液 FP1 可能会发黄，并不影响提取效果。若 Buffer QP1 或 Buffer QP2 有沉淀析 出，可在 37℃水浴溶解，摇匀后使用； 2. 所有离心步骤均为使用台式离心机，室温下离心； 3. 样品应避免反复冻融，否则会导致提取的 DNA 片段较小且提取量也下降。
（注意：使用前在 BufferGP1 中加入 β-巯基乙醇，使其终浓度为 0.2%，水浴锅中 65°C 预热） 1. 取植物新鲜组织约 100 mg 或干组织约 30 mg，加入液氮充分研磨。 （注意：如果组织为较幼嫩部分，可不用液氮研磨，直接在研钵中加入 700 μl Buffer GP1 和组织一起研磨即可） 2. 将研磨后的粉末收集到一离心管（自备）中，加入 700 ul 65°C 预热的 Buffer GP1 （使用前在预热的 Buffer GP1 中加入 β-巯基乙醇，使其终浓度为 0.2%），迅速颠倒混匀或用 涡旋振荡器充分振荡混匀，然后将离心管置于 65°C 水浴 20 min，期间每隔 3 ~ 5 min 颠倒离心管混匀样品一次。 （注意：如要去除 RNA，可在上述步骤完成后加入浓度为 100mg/ml 的 RNaseA 4 μl，振荡混匀，室 温处理 5~10min） 3. 加入 700 μl 氯仿，充分混匀，12,000 rpm 离心 5 min。 （注意：如果提取的植物材料富含多酚或淀粉，可在第 3 步骤前用酚：氯仿/1：1 进行等体积抽提）4. 小心将上层水相转入一新的离心管（自备）中，加入 700 μl Buffer GP2，充分混匀。 将混匀后的溶液转入离心吸附柱中，若一次不能转移完成，可分次加入，12,000 rpm 离心 30 sec，弃收集管中废液。 5. 向吸附柱内加入 500 μl 的 Buffer W1，室温 12,000 rpm 离心 30 sec，弃收集管中废 液。 （注意：Buffer W1 是浓缩液，按要求加入乙醇，用后及时盖紧，以防乙醇挥发） 6. 向吸附柱内加入 500 μl 的 Buffer ...
（注意：以下举例为常规PCR体系和反应条件，实际操作中应根据模板、引物结构和目的片段大小 不同进行相应的调整和优化） 1. PCR体系 推荐反应体系（20 μl）试剂用量模板 DNAPrimer 1 (10 μM)0.5 μlPrimer 2 (10 μM)0.5 μl2×Pfu PCR MasterMix10 μlddH2OUp to 20 μl（注意：引物浓度请以终浓度 0.1 - 1.0 μM 作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下，可提高引 物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系） 2. PCR 程序过程温度时间预变性94℃2 min变性94℃30 sec25 ~ 35cycles 退火55 ~ 65℃30 sec延伸72℃60 sec/kb最后延伸72℃5 min（注意：a 一般实验中退火温度比扩增引物的熔解温度 Tm 低 5℃，无法得到理想的扩增效率 时，适当降低退火温度；发生非特异性反应时，提高退火温度，由此优化反应条件。b 延伸时间应 根据所扩增片段大小设定，Pfu DNA Polymerase 的扩增效率为1 kb/min。c 可根据扩增产物的下游 应用设定循环数。如果循环次数太少，扩增量不足；如果循环次数太多，错配机率会增加，非特异 性背景严重。所以，在保证产物得率的前提下，应尽量减少循环次数） 3. 结果检测：反应结束后取5 μl反应产物，加入适量上样缓冲液（含染料的不用加）， 然后进行琼脂糖凝胶电泳检测。
1. 如 Buffer GTL 和 Buffer GL 产生沉淀，可在 56℃水浴溶解； 2. 样品应避免反复冻融，否则会导致提取的 DNA 片段小，提取量下降； 3. 所有离心步骤均为台式离心机，室温下操作。
1. 去除基因组：根据以下表格配制反应体系，总体积为 10μl。为了保证反应液配制的准 确性，先按反应数+2 的量配制预混体系，然后再分装到每个反应管中，最后加入 RNA。10×gDNA Remover1 μlRNA 模板0.01~1μgDEPC-ddH2O补足至 10μl(注意：如果总 RNA 量大于 1 ug，请按比例扩大反应体系)将反应液轻轻搅拌均匀，短暂离心使管壁上的溶液收集到管底，室温或 25-37℃温育 5 分钟。 2. 反转录反应：在上述反应液中加入 4μl 5×cDNA RT Mix，6μl DEPC-ddH2O,轻轻混匀， 短暂离心；50℃孵育 5-15 分钟；85℃加热 3 分钟使酶失活；置于冰上进行后续实验或 冷冻保存。 注意：Real-time qPCR 时，作为模板直接稀释后添加（添加到 PCR 反应液中的反转录稀释液，尽 量不要超过 20%，以免导致 PCR 反应效率低下，无法准确定量）