(注意:使用前在 BufferGP1 中加入 β-巯基乙醇,使其终浓度为 0.2%,水浴锅中 65°C 预热)
1. 取植物新鲜组织约 100 mg 或干组织约 30 mg,加入液氮充分研磨。
(注意:如果组织为较幼嫩部分,可不用液氮研磨,直接在研钵中加入 700 μl Buffer GP1 和组织一起研磨即可)
2. 将研磨后的粉末收集到一离心管(自备)中,加入 700 ul 65°C 预热的 Buffer GP1
(使用前在预热的 Buffer GP1 中加入 β-巯基乙醇,使其终浓度为 0.2%),
迅速颠倒混匀或用 涡旋振荡器充分振荡混匀,然后将离心管置于 65°C 水浴 20 min,期间每隔 3 ~ 5 min 颠倒离心管混匀样品一次。
(注意:如要去除 RNA,可在上述步骤完成后加入浓度为 100mg/ml 的 RNaseA 4 μl,振荡混匀,室 温处理 5~10min)
3. 加入 700 μl 氯仿,充分混匀,12,000 rpm 离心 5 min。
(注意:如果提取的植物材料富含多酚或淀粉,可在第 3 步骤前用酚:氯仿/1:1 进行等体积抽提)
4. 小心将上层水相转入一新的离心管(自备)中,加入 700 μl Buffer GP2,充分混匀。 将混匀后的溶液转入离心吸附柱中,若一次不能转移完成,可分次加入,12,000 rpm 离心 30 sec,弃收集管中废液。
5. 向吸附柱内加入 500 μl 的 Buffer W1,室温 12,000 rpm 离心 30 sec,弃收集管中废 液。
(注意:Buffer W1 是浓缩液,按要求加入乙醇,用后及时盖紧,以防乙醇挥发)
6. 向吸附柱内加入 500 μl 的 Buffer W2,室温 12,000 rpm 离心 30 sec,弃收集管中废 液。
(注意:Buffer W2 是浓缩液,按要求加入乙醇,用后及时盖紧,以防乙醇挥发)
7. 重复步骤 7 一次。 8. 室温 12,000 rpm 离心 2 min,甩干吸附柱上的残留液体。
(注意:此步不能省略,否则残留乙醇会影响基因组 DNA 的后续使用)
9. 将离心吸附柱置于一个新的 1.5 ml 塑料离心管(自备)中,加入 50-100 μl Buffer EB,室温放置 2 min。12,000 rpm 离心 2 min,离心管底溶液即基因组 DNA。
(注意:为增加洗脱效率,可将洗脱液在 50~60°C 预热。如需使用去离子水洗脱,可用 NaOH 调整 其 pH 值在 7.0~8.5 之间,为了增加 DNA 回收率,可将得到的溶液重新加入到离心管中,室温放置 2min,再次离心收集)