(注意:以下举例为推荐PCR体系和反应条件,实际操作中应根据模板、引物结构和目的片段大小不同进行相应的调整和优化)
1. PCR体系
推荐反应体系(20 μl)
试剂 | 用量 |
模板DNA | < 1μg |
Primer mix (10 μM each) | 0.5 μl |
10 × Multiplex Buffer | 2 μl |
Multiplex DNA Polymerase | 1 μl |
dNTP(10mM) | 0.5 μl |
ddH2O | Up to 20 μl |
(注意:推荐引物反应终浓度为每条引物0.1 μM,可在0.05 - 0.4 μM之间调整。)
2. PCR程序
过程 | 温度 | 时间 |
预变性 | 95℃ | 5 min |
25 ~ 35 cycles | 变性 | 95℃ | 30 sec |
退火 | 55 ~ 65℃ | 30 sec |
延伸 | 72℃ | 60 sec/kb |
最后延伸 | 72℃ | 5 min |
(注意:a. 多数情况下,使用默认退火温度即可。如扩增效果不佳,可通过设置退火温度梯度实验来摸索最适退火温度。b. 预变性时间为5 min,用于充分释放酶活。请勿降低温度或缩短时间。c. 对于低拷贝模板、长片段或者扩增片段较多的情况,可延长退火时间至3 min以提高扩增效率。d. 延伸时间以最长片段为准设定。适度延长延伸时间有助于提高扩增产量且有利于困难模板扩增。延伸时间过长可能会导致非特异性扩增增多。e. 扩增微量样本时,可通过增加循环数提高扩增产物量。循环数过多可能会导致非特异性扩增增多。)