1. 去除基因组:根据以下表格配制反应体系,总体积为 10μl。为了保证反应液配制的准 确性,先按反应数+2 的量配制预混体系,然后再分装到每个反应管中,最后加入 RNA。
10×gDNA Remover | 1 μl |
RNA 模板 | 0.01~1μg |
DEPC-ddH2O | 补足至 10μl |
(注意:如果总 RNA 量大于 1 ug,请按比例扩大反应体系)
将反应液轻轻搅拌均匀,短暂离心使管壁上的溶液收集到管底,室温或 25-37℃温育 5 分钟。
2. 反转录反应:在上述反应液中加入 4μl 5×cDNA RT Mix,6μl DEPC-ddH2O,轻轻混匀, 短暂离心;50℃孵育 5-15 分钟;85℃加热 3 分钟使酶失活;置于冰上进行后续实验或 冷冻保存。
注意:Real-time qPCR 时,作为模板直接稀释后添加(添加到 PCR 反应液中的反转录稀释液,尽 量不要超过 20%,以免导致 PCR 反应效率低下,无法准确定量)