（注意：以下举例为常规PCR反应体系和反应条件，实际操作中应根据模板、引物结构和目的 片段大小不同进行相应的调整和优化） 1. PCR 体系： 推荐体系（50 μl）试剂用量模板 DNA10 × Taq Plus Buffer5 μldNTP Mixture(2.5 mM each)4 μlPrimer 1 (10 μM)2 μlPrimer 2 (10 μM)2 μlHotstart Taq Plus DNA Polymerase (2.5 U/μl)0.5 ~ 1 μlddH2OUp to 50 μl（注意：a 引物浓度请以终浓度 0.1-1.0μM 作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。b 镁离子浓度请以 终浓度 1.5-3mM 作为设定范围的参考。可根据不同的引物对和模板来调节镁离子浓度，由此优 化反应体系）2. PCR 程序过程温度时间预变性94℃5 min变性94℃30 sec25~35cycles 退火55-65℃30 sec延伸72℃1kb/30 sec终延伸72℃5 min（注意：a 一般实验中退火温度比扩增引物的熔解温度 Tm 低 5℃，无法得到理想的扩增效率时， 适当降低退火温度；发生非特异性反应时，提高退火温度，由此优化反应条件。b 延伸时间应根 据所扩增片段大小设定，Hotstart Taq Plus DNA Polymerase 的扩增效率为 1 kb/20-30 sec。c 可 根据扩增产物的下游应用设定循环数。如果循环次数太少，扩增量不足；如果循环次数太多，错 配机率会增加，非特异性背景严重。所以，在保证产物得率的前提下，应尽量减少循环次数）3. 结果检测：反应结束后取 5 μl 反应产物，加入适量上样缓冲液后进行琼脂糖凝胶...
（注意：以下举例为常规qPCR 反应体系和反应程序，实际操作中应根据模板、引物结构和目的 片段大小不同进行相应的改进和优化） 1. 根据以下表格配置反应体系，总体积为20 μl试剂用量终浓度2 × Probe qPCR Mix10 μl1 ×正义引物 (10 μM)0.5 μl0.25 μM反义引物 (10 μM)0.5 μl0.25 μM探针(10 μM)0.5 μl0.25 μM模板 DNAx μlDEPC-ddH2OUp to 20 μl注意：1）通常引物浓度以 0.25 μM 可以得到较好结果，可以在 0.1 ~ 1.0 μM 作为设定范围的参考。 2）使用的探针浓度，与使用的荧光定量 PCR 仪、探针种类、荧光标记物质种类有关，实际使用时 请参照仪器说明书，或各荧光探针的具体使用要求进行浓度的调节。 3）通常 DNA 模板的量以 10-100 ng 基因组 DNA 或 1-10 ng cDNA 为参照，因不同物种的模板中含 有的目的基因拷贝数不同，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。 2. qPCR 反应程序，两步法 PCR：过程温度时间预变性95℃5 min35 ~ 40cycles变性95℃15 sec退火/延伸60℃30 sec（注意：建议采用两步法 PCR 反应程序，若因使用 Tm 值较低的引物等原因，得不到良好的实验结 果时，可尝试进行三步法 PCR 扩增，退火温度请以 55℃ - 65℃的范围作为设定参考）
（注意：以下举例为常规qPCR 反应体系和反应程序，实际操作中应根据模板、引物结构和目的 片段大小不同进行相应的改进和优化） 1. 将DNA模板、引物、2×SYBR qPCR Mix、50 × ROX Reference Dye I/II溶解并置于 冰上备用。 2. 根据以下表格配置反应体系，总体积为20 μl。试剂用量终浓度2 ×SYBR qPCR Mix10 μl1 ×正义引物 (10 μM)0.5 μl0.25 μM反义引物 (10 μM)0.5 μl0.25 μM模板DNAx μl50× ROX Reference Dye I or II0.4 μl1 ×ddH2OUp to 20 μl（注意：a.通常引物浓度以 0.25 μM 可以得到较好结果，可以终浓度 0.1-1.0 μM 作为设定范围的参 考。扩增效率不高的情况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化 反应体系；b.通常 DNA 模板的量以 10-100 ng 基因组 DNA 或 1-10 ng cDNA 为参照，因不同物种的 模板中含有的目的基因拷贝数不同，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。)需使用 ROX Reference Dye I 的机型：ABI Prism5700、7000、7300、7700、7900、7900HT、 7900HT Fast、Step-One、Step-One Plus。 需使用 ROX Reference Dye II 的机型： ABI Prism 7500/7500Fast 、 ViiA7, QuantStudio3/5/6Flex/7Flex, Stratagene MX4000/MX3005P/MX300...
1. 易错PCR体系推荐反应体系（30 μl）试剂用量模板DNA10-100 ngPrimer F (10 μM)1 μlPrimer R (10 μM)1 μl2× Error Prone PCR Mix15 μl10× MnCl23 μlddH2OUp to 30 μl2. 易错PCR程序 按用户已经优化的PCR条件进行一定循环数的PCR，如果没有优化的PCR条件，可 先尝试下面的PCR程序。过程温度时间预变性94℃3 min30-60 cycles变性94℃30 sec退火45℃30 sec延伸72℃1 min/kb3. 结果检测：反应结束后取5 μl反应产物，加入适量上样缓冲液，然后进行琼脂糖凝 胶电泳，检测是否得到预期片段大小的PCR产物。4. 胶回收易错PCR扩增产物、克隆并对单菌落进行功能筛选或测序分析、如果需要增 加突变率，可以突变后的DNA为模板，进行连续易错PCR。
1. 没有RNA产物。 最常见原因是模板有RNase污染，可用纯化好的RNA跟模板DNA一起保温再电泳， 再检测其是否有污染。 2. RNA产量低。 最常见的原因是DNA模板。在转录序列的第一个和第二个碱基最好都是G，在前14 个碱基内避免有U存在。 3. RNA长度比预期的短。 可能是模板序列中有T7 RNA聚合酶的终止序列。 4. RNA长度比预计的长。 T7 RNA聚合酶跟Taq DNA聚合酶一样，有不依赖于模板的加尾功能，最多有一半 的RNA可以带一个或两个碱基的尾巴。如果RNA长度比预计的长很多，使用的模板 又是 质粒DNA，则可能是质粒线性化不彻底。5. 5′单磷酸还是三磷酸? 如果使用GTP，则得到的RNA是三磷酸，体外转录时如果保温时间太长（如12小 时），则有50%的三磷酸会变成单磷酸。如果在转录体系中加入GMP，则T7 RNA聚 合 酶将优先使用GMP，所得RNA产物中5'端是单磷酸的比例将大大增加。 6. 用体外转录试剂盒如何得到带帽RNA? 需加入带帽NTP类似物即可。
1. 在 1.5ml 离心管中加入 100 μl 溶液 A。 2. 将 3-10 mg 植物叶片直接加到溶液 A 中，用枪头捣碎。如果样品为种子，则将种子敲 碎，然后取一碎片（约 1/4 豌豆大小）进行后续实验步骤。 3. 95℃孵育 10 min，对于比较难裂解的样品，适当延长保温时间至 15-30 min。 4. 加入 100 μl 溶液 B，简短振荡混匀后可直接取上清为模板进行 PCR 扩增。（注：裂解液体积不要超过反应体积的 1/10，建议做梯度稀释测试以确定最佳反应体系。本产品提取 的 DNA 不能用电泳检测方法检测，只能用作扩增模板）