1. PCR 体系：推荐体系（50 μl）试剂用量模板 DNA10 × Taq PCR Buffer5 μldNTP Mixture(2.5 mM each)4 μlPrimer 1 (10 μM)2 μlPrimer 2 (10 μM)2 μlTaq DNA Polymerase (2.5 U/μl)0.5 ~ 1 μlddH2OUp to 50 μl（注意：a 引物浓度请以终浓度 0.1-1.0μM 作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下，可提 高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。b 镁离子浓度请以 终浓度 1.5-3mM 作为设定范围的参考。可根据不同的引物对和模板来调节镁离子浓度，由此优化反应体系）2. PCR 程序过程温度时间预变性94℃5 min变性94℃30 sec25~35cycles 退火55-65℃30 sec延伸72℃1kb/30 sec终延伸72℃5 min（注意：a 一般实验中退火温度比扩增引物的熔解温度 Tm 低 5℃，无法得到理想的扩增效率时， 适当降低退火温度；发生非特异性反应时，提高退火温度，由此优化反应条件。b 延伸时间应根 据所扩增片段大小设定，Taq DNA Polymerase 的扩增效率为 1 kb/30 sec。c 可根据扩增产物的下 游应用设定循环数。如果循环次数太少，扩增量不足；如果循环次数太多，错配机率会增加，非 特异性背景严重。所以，在保证产物得率的前提下，应尽量减少循环次数）3. 结果检测：反应结束后取 5 μl 反应产物，加入适量上样缓冲液后进行琼脂糖凝胶电泳 检测。
1. PCR 体系： 推荐体系（50 ul）试剂用量模板 DNA10 × Taq PCR Buffer5 μldNTP Mixture(2.5 mM each)4 μlPrimer 1 (10 μM)2 μlPrimer 2 (10 μM)2 μlHotstart Taq DNA Polymerase (2.5 U/μl)0.5 ~ 1 μlddH2OUp to 50 μl（注意：a 引物浓度请以终浓度 0.1-1.0μM 作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下，可提 高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。b 镁离子浓度请以 终浓度 1.5-3mM 作为设定范围的参考。可根据不同的引物对和模板来调节镁离子浓度，由此优化反应体系）2. PCR 程序过程温度时间预变性94℃5 min变性94℃30 sec25~35cycles 退火55-65℃30 sec延伸72℃1kb/30 sec终延伸72℃5 min（注意：a 一般实验中退火温度比扩增引物的熔解温度 Tm 低 5℃，无法得到理想的扩增效率时，适当降低退火温度；发生非特异性反应时，提高退火温度，由此优化反应条件。b 延伸时间应根据所扩增片段大小设定，Hotstart Taq DNA Polymerase 的扩增效率为 1 kb/30 sec。c 可根据扩增产物的下游应用设定循环数。如果循环次数太少，扩增量不足；如果循环次数太多，错配机率会增加，非特异性背景严重。所以，在保证产物得率的前提下，应尽量减少循环次数）3. 结果检测：反应结束后取 5 μl 反应产物，加入适量上样缓冲液后进行琼脂糖凝胶电泳检测。
a .一般实验中退火温度比扩增引物的熔解温度 Tm 低 5℃，无法得到理想的扩增效率时，适 当降低退火温度；发生非特异性反应时，提高退火温度，由此优化反应条件。b .延伸时间应根据所扩 增片段大小设定，Taq DNA Polymerase 的扩增效率为 1 kb/30 sec。c .可根据扩增产物的下游应用设定 循环数。如果循环次数太少，扩增量不足；如果循环次数太多，错配机率会增加，非特异性背景严重。 所以，在保证产物得率的前提 下，应尽量减少循环次数
注意： a：扩增 5 kb 的产物时，建议使用 95℃ 5 min 预变性处理。 b-1：退火温度：最适 Tm 与引物间的平均温度相近，若引物间 Tm 值偏差较大，最适 Tm 用引物的 最低 Tm+1-2℃）,b-2：退火时间：对于含兼并引物、复杂模板的扩增，建议退火时间延长至 30 s。 c：适合的延伸温度：68-75℃；推荐的延伸速度：10-15 s/kb；质粒等简单模板：5-10 s/kb；常规基 因组模板：10-15 s/kb；复杂模板、脏模板：15-25 s/kb；略微 增加延伸时间（5-10 s/kb）有利于提高 低浓度、复杂模板 PCR 的产量，但总延伸时间不超过 30 s/kb）
（注意：以下举例为常规PCR反应体系和反应条件，实际操作中应根据模板、引物结构和目的 片段大小不同进行相应的调整和优化）1. PCR 体系： 推荐体系（50 μl）试剂用量模板 DNA10 × Taq Plus Buffer5 μldNTP Mixture(2.5 mM each)4 μlPrimer 1 (10 μM)2 μlPrimer 2 (10 μM)2 μlTaq Plus DNA Polymerase (2.5 U/μl)0.5 ~ 1 μlddH2OUp to 50 μl（注意：a 引物浓度请以终浓度 0.1-1.0μM 作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。b 镁离子浓度请以 终浓度 1.5-3mM 作为设定范围的参考。可根据不同的引物对和模板来调节镁离子浓度，由此优 化反应体系）2. PCR 程序过程温度时间预变性94℃5 min变性94℃30 sec25~35cycles 退火55-65℃30 sec延伸72℃1kb/30 sec终延伸72℃5 min（注意：a 一般实验中退火温度比扩增引物的熔解温度 Tm 低 5℃，无法得到理想的扩增效率时， 适当降低退火温度；发生非特异性反应时，提高退火温度，由此优化反应条件。b 延伸时间应根 据所扩增片段大小设定，Taq Plus DNA Polymerase 的扩增效率为 1 kb/30 sec。c 可根据扩增产 物的下游应用设定循环数。如果循环次数太少，扩增量不足；如果循环次数太多，错配机率会增 加，非特异性背景严重。所以，在保证产物得率的前提下，应尽量减少循环次数） 3. 结果检测：反应结束后取 5 μl 反应产物，加入适量上样缓冲液后进行琼脂糖凝胶电泳检测
（注意：以下举例为常规PCR 反应体系和反应条件，实际操作中应根据模板、引物结构和目的 片段大小不同进行相应的调整和优化） 1. PCR 体系：推荐体系（50 ul）试剂用量模板 DNA10×快速高保真 Buffer5 μldNTP Mixture(2.5 mM each)4 μlPrimer 1 (10 μM)2 μlPrimer 2 (10 μM)2 μl快速高保真 DNA 聚合酶（野生型）0.5 ~ 1 μlddH2OUp to 50 μl2. PCR 程序过程温度时间预变性94℃5 min变性94℃30 sec25~35cycles 退火55-65℃30 sec延伸72℃1kb/15 sec终延伸72℃5 min（注意：a 一般实验中退火温度与扩增引物的熔解温度 Tm 相当，无法得到理想的扩增效率时， 适当降低退火温度；发生非特异性反应时，提高退火温度，由此优化反应条件。） 3. 结果检测：反应结束后取 5 μl 反应产物，加入适量上样缓冲液后进行琼脂糖凝胶电泳 检测。